Исследование функциональных характеристик изоформ сердечного миозина

НазваниеИсследование функциональных характеристик изоформ сердечного миозина
страница1/2
Копылова Галина Васильевна
Дата конвертации25.12.2012
Размер301,7 Kb.
ТипАвтореферат
  1   2
На правах рукописи


Копылова Галина Васильевна


ИССЛЕДОВАНИЕ ФУНКЦИОНАЛЬНЫХ ХАРАКТЕРИСТИК ИЗОФОРМ СЕРДЕЧНОГО МИОЗИНА


03.03.01 – физиология


Автореферат


диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук


Екатеринбург - 2011


Работа выполнена в лаборатории биологической подвижности Учреждения Российской академии наук Института иммунологии и физиологии Уральского отделения РАН


Научные руководители: Доктор биологических наук

Бершицкий Сергей Юрьевич,


кандидат биологических наук, в.н.с.

Никитина Лариса Валерьевна


Официальные оппоненты: Член-корреспондент РАН, ЗДНРФ,

доктор биологических наук, профессор Мархасин Владимир Семенович,


лауреат Государственной премии РФ,

доктор биологических наук

Прошева Валентина Ивановна


Ведущая организация: ФГУ «Российский кардиологический научно-производственный комплекс» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации


Защита состоится «___» ______________2011 г. в _______ часов на заседании совета по защите кандидатских и докторских диссертаций Д 004.027.01 при учреждении РАН Институте иммунологии и физиологии УрО РАН по адресу: 620049, Российская Федерация, г. Екатеринбург, ул. Первомайская, 106.


С диссертацией можно ознакомиться в Центральной научной библиотеке УрО РАН (620041, г. Екатеринбург, ул. С. Ковалевской, д. 22/20), с авторефератом — на сайте учреждения РАН Института иммунологии и физиологии УрО РАН - http://www.iip.uran.ru


Автореферат разослан «___» ______________2011 г.


Ученый секретарь совета по защите кандидатских

и докторских диссертаций Д 004.027.01 при учреждении РАН

Институте иммунологии и физиологии УрО РАН,

доктор медицинских наук, профессор И. А. Тузанкина

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность

Согласно данным ВОЗ, смертность от сердечно-сосудистых заболеваний занимает первое место в мире. Факторы, которые приводят к нарушению работы сердца, многочисленны, но все они, так или иначе, влияют на сократительную функцию кардиомиоцита. Нарушение сократительной функции кардиомиоцита может происходить из-за изменения состава белков сократительного аппарата или вследствие разобщения процессов сопряжения возбуждения с сокращением.

Как известно, генерация силы в мышце осуществляется за счет энергии гидролиза ATФ поперечными мостиками, образованными головками миозиновых молекул, прикрепленными к нитям актина. В сердце млекопитающих имеется два типа тяжелых цепей миозина (ТЦМ): α и  [Hoh et al.,1977]. Изоформа миозина V1 является гомодимером α-тяжелых цепей, а изоформа миозина V3 – гомодимером -тяжелых цепей. По аминокислотной последовательности V1 и V3 изомиозины идентичны на 93 % [Alpert et al., 2002]. Разница в аминокислотных последовательностях между α- и β-ТЦМ определяет различие их кинетических и механических свойств [Alpert et al., 2002; Krenz et al., 2007].

В рамках интактного сердца имеется заметное различие в экспрессии изоформ миозина V1 и V3 в кардиомиоцитах из разных слоев стенки желудочка [Eisenberg et al., 1985; Litten et al., 1985; Carnes et al., 2004; Reiser et al., 2001]. Экспрессия этих изоформ миозинов зависит от вида животного, его возраста и гормонального статуса [Lompre et al., 1979]. Изменения в экспрессии изоформ происходят также при патологиях сердца [Lompre et al., 1979; van der Velden et al., 1999; Miyata et al., 2000].

Изоформы сердечного миозина отличаются по своим гидролитическим и механическим характеристикам [Sata et al., 1993; Harris et al., 1994; VanBuren et al., 1995; Noguchi et al., 2003; Malmqvist et al., 2004]. На уровне взаимодействия одиночных молекул миозина и актина обнаружено, что изомиозины V1 и V3 отличаются только длительностью единичных перемещений нитей актина [Sugiura et al.,1998; Palmiter et al., 1999].

Наличие изоформ сердечного миозина является приспособлением для оптимизации сократительной функции сердца. Левый желудочек сердца взрослого человека содержит около 7 % α-тяжелых цепей миозина [Miyata et al., 2000]. При ишемической и дилатационной кардиомиопатии α-изоформа не обнаруживается [Reiser et al., 2001], что снижает сократимость, но повышает экономичность сокращения [Alpert NR, 1972].

В первой половине 90-х годов были обнаружены мутантные формы β-цепи миозина (сейчас их известно более ста), приводящие к выраженным клиническим симптомам гипертрофической либо дилатационной кардиомиопатии, которые могут приводить к внезапной смерти [Schmitt et al., 2006].

Различие в соотношениях изоформ V1 и V3 в кардиомиоците, прежде всего, прямо проявляется в различных скоростных характеристиках развития напряжения. Кроме того, очень важен вклад, который разные соотношения изомиозинов вносят в механическую функцию в миокарде через кооперативное влияние прикрепленных поперечных мостиков на сродство тропонина С к кальцию (через механизм мостико–тропониновой кооперативности). Это кооперативное взаимодействие регуляторных и сократительных белков является ключевым механизмом, объясняющим целый ряд феноменов биомеханики активного миокарда, связанных с влиянием механических условий сокращений на активацию сердечной мышцы [Izakov et al., 1991].

Влияние изоформ сердечного миозина на кальциевую регуляцию сокращения сердечной мышцы изучалось в экспериментах на скинированных кардиомиоцитах и препаратах сердечной мышцы [Fitzsimons et al 1998; Metzger et al, 1999; Rundel et al. 2004, 2005; Krenz et al., 2007; Stelzer et al. 2007, 2008]. В настоящем имеется только одна работа по изучению вклада изоформ сердечного миозина в кальциевую регуляцию сокращений миокарда методом искусственной подвижной системы [Noguchi et al., 2003]. Имеющаяся на сегодня информация о вкладе изоформ сердечного миозина в кальциевую регуляцию сокращения сердечной мышцы являются неполной и противоречивой.

Использование метода искусственной подвижной системы позволяет изучать непосредственно взаимодействие регуляторных и сократительных белков на уровне тонкого филамента, что дает возможность избежать артефактов, связанных с пассивными механическими свойствами целой мышцы, либо кардиомиоцита. В рамках этого метода можно задавать различные концентрации свободного кальция и регистрировать связи «pCa-скорость», «pCa-сила», «сила-скорость» на уровне взаимодействующих белков.

Цель работы

Провести систематическое исследование функциональных характеристик изоформ сердечного миозина кролика и оценить их вклад в кальциевую регуляцию сокращений сердечной мышцы.

Задачи исследования

  1. Исследовать функциональные свойства изоформ сердечного миозина кролика V1 и V3, а именно: актин-активируемую Mg2+-АТФ-азную активность, силогенерирующие и кинетические характеристики.

  2. В искусственной подвижной системе с регулируемым тонким филаментом исследовать зависимости «рСа-скорость», «рСа-сила» для изоформ сердечного миозина V1 и V3.

  3. Исследовать связь «сила-скорость» для изоформ сердечного миозина V1 и V3 при насыщающей и ненасыщающей концентрациях кальция в растворе методом искусственной подвижной системы с регулируемым тонким филаментом.

  4. Получить и проанализировать зависимость «сила-мощность» для изоформ сердечного миозина V1 и V3 при насыщающей и ненасыщающей концентрациях кальция в растворе.

  5. Проанализировать вклад изоформ сердечного миозина V1 и V3 в кальциевую регуляцию сокращений сердечной мышцы.

Научная новизна

Впервые систематически исследованы функциональные характеристики изоформ V1 и V3 сердечного миозина кролика, используя метод искусственной подвижной системы. Получена и проанализирована связь «рСа-скорость» для изоформ сердечного миозина V1 и V3. Показано, что кальциевая чувствительность и коэффициент Хилла зависимости «рСа-скорость» для изоформ V1 и V3 сердечного миозина не отличаются.

Впервые изучена связь «рСа-сила» для изоформ сердечного миозина V1 и V3. Показано, что при низкой концентрации каждой из изоформ как коэффициент кооперативности, так и кальциевая чувствительность выше для V3, чем для V1, что может иметь адаптивное значение при патологиях, связанных со снижением концентрации миозина.

Впервые на уровне взаимодействующих ансамблей молекул сократительных белков показано, что основные характеристики зависимостей «сила-скорость» и «сила-мощность» сокращения кардиомиоцита и сердечной мышцы в целом определяются свойствами изоформ миозина.

Научная и практическая значимость

Получены новые данные о роли изоформ сердечного миозина в кальциевой регуляции сокращения сердечной мышцы. С помощью метода искусственной подвижной системы показано, что механические свойства сокращения кардиомиоцита и сердечной мышцы в целом определяются составом тяжелых цепей изоформ сердечного миозина. Эти новые данные необходимы для понимания работы сердечной мышцы в норме и ее нарушениях при патологиях сердца, приводящих к изменению состава тяжелых цепей миозина.

Внедрение

Результаты диссертационной работы используются в учебном процессе на кафедре экспериментальной физики физико-технического факультета Уральского федерального университета имени первого Президента России Б.Н.Ельцина; на кафедре нормальной физиологии ГОУ ВПО «Уральской государственной медицинской академии Минздравсоцразвития России».

Положения, выносимые на защиту

  1. Значения коэффициента кооперативности Хилла зависимости «рСа-сила» для изоформ сердечного миозина V1 и V3 в искусственной подвижной системе при высокой концентрации миозина не отличаются, кальциевая чувствительность выше для изоформы V3; при низкой концентрации каждой из изоформ как коэффициент кооперативности, так и кальциевая чувствительность выше для V3, чем для V1.

  2. Зависимость «сила-скорость» для изоформ V1 и V3 в искусственной подвижной системе при насыщающей и ненасыщающей концентрациях кальция соответствует гиперболическому уравнению Хилла в области малых нагрузок и отклоняется от него в области больших нагрузок; зависимости «сила-скорость» для изоформ V1 и V3 отличаются при насыщающей и ненасыщающей концентрациях кальция; изоформный состав миозина определяет форму связи «сила-скорость» в мышечных препаратах.

  3. Максимум развиваемой мощности изоформы V1 выше, чем изоформы V3 и сдвинут в сторону меньших нагрузок при насыщающей и ненасыщающей концентрациях кальция, что может иметь адаптивное значение для поддержания мощности на заданном уровне; мощность, развиваемая каждой из изоформ миозина, не зависит от концентрации свободного кальция во всем диапазоне нагрузок.

Апробация работы и публикации. Результаты работы были представлены на международных конференциях «Biological motility: Basic research and practice» (г. Пущино, 2006 г.); «Biological motility: Achievements and Perspectives» (г. Пущино, 2008 г.); «Biological motility: from Fundamental Achievements to Nanotechnologies» (г. Пущино, 2010 г.); на Международном форуме по нанотехнологиям (г. Москва, 2008 г.); на XXXIV и XXXVI «European Muscle Congress» (г. Дебрецен, Венгрия, 2005 г.; Стокгольм, Швеция, 2007 г.); Joint British-Russian Young Scientists Workshop (Екатеринбург, 2007 г.).

По теме диссертации опубликовано 12 печатных работ, в том числе в изданиях, рекомендованных ВАК – 7 публикаций.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, пяти глав, выводов и списка цитируемой литературы (188 источников). Диссертация изложена на 151 странице, содержит 20 рисунков.

Работа была выполнена при поддержке грантов РФФИ, Программы фундаментальных исследований Президиума РАН, гранта Президента РФ для государственной поддержки ведущей школы РФ, HHMI и ИНТАС.

Автор приносит благодарности д.ф.-м. н. Кацнельсону Л.Б. за консультации при построении связей «рСа-скорость», «рСа-сила», «сила-скорость» и обсуждению полученных результатов; Щепкину Д.В. за помощь в проведении экспериментов; к.б.н. Машанову Г.И. за любезно предоставленную программу записи и обработки видеоизображения; Бершицкому Б.Ю. за техническую поддержку экспериментов.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Обзор литературы

В обзоре литературы рассматриваются особенности строения, свойства и функциональное значение изоформ сердечного миозина. Представлен обзор исследований вклада изоформ сердечного миозина в кальциевую регуляцию сокращения сердца, полученных в экспериментах на скинированных кардиомиоцитах и препаратах сердечной мышцы, а также методом искусственной подвижной системы. Показано, что имеющаяся на сегодня информация о влиянии изоформ сердечного миозина на кальциевую регуляцию, является неполной и противоречивой.

Материал и методы исследования

Растворы. Состав буфера АВ: 25 мМ KCl, 25 мМ имидазола, 4 мМ MgCl2, 1 мМ ЭГТА и 10 мМ дитиотриэтола, pH 7,5.

Получение белков. Актин выделяли из ацетонового порошка по стандартной методике [Pardee and Spudich, 1982]. Сердечные тропомиозин и тропонин выделяли из миокарда левого желудочка сердца быка методами Smille, 1982 и Potter, 1982 с небольшими модификациями.

Изоформа V1 миозина была получена из миокарда левого желудочка гипертиреоидных, изоформа V3 – гипотиреоидных кроликов [Litten et al., 1985, vanBuren et al., 1995]. Миозин выделяли из левого желудочка сердца кролика по стандартной методике [Margossian и Lowey, 1982] с небольшими модификациями. Состав тяжелых цепей сердечного миозина проверялся методом ПААГ-электрофореза [van der Velden et al., 1999]. Миокард левого желудочка гипертиреоидных кроликов содержал преимущественно изоформу миозина V1 (~90%), гипотиреоидных – изоформу миозина V3 (~90%). В день эксперимента неработающие молекулы миозина удаляли ультрацентрифугированием с F-актином и АТФ [Gordon et al., 1997].

Получение регулируемого тонкого филамента. Регулируемый тонкий филамент, состоящий из актина, тропонина и тропомиозина реконструировали путем смешивания этих белков в следующих концентрациях: 400 нМ ТМРФ-F-актина, 80 нМ тропонина и 100 нМ тропомиозина при 4 ºС в буфере АВ. Соотношение белков в регулируемых тонких филаментах проверяли с помощью ПААГ-электрофореза [Laemmli, 1970].

Измерение АТФ-азной активности. Актин-активируемая Mg2+-АТФазная активность миозина измерялась колориметрическим методом по свободному неорганическому фосфату [Kodama et al., 1986] при 28 ºC в буфере АВ, содержащем 0,05 мкМ миозина, от 10 до 30 мкМ F-актина и 1 мМ АТФ. Основные параметры кинетики Михаэлиса-Ментен определялись с помощью графика Лайнуивера-Бэрка.

Эксперименты на искусственной подвижной системе. Для установки был использован инвертированный флуоресцентный микроскоп (Axiovert 200 М, Carl Zeiss MicroImaging GmbH), укомплектованный ртутной лампой HBO 100, набором фильтров для тетраметилродамина (ТРМФ) и масляно-имерсионным объективом Alpha Plan-Fluar 100×1,45 (Carl Zeiss MicroImaging GmbH). Изображение меченого актина регистрировалось с помощью EMCCD видеокамеры (Andor Technology) и записывалось на жесткий диск компьютера с помощью программы GMimPro [Mashanov et al., 2007].

Проточная камера состояла из предметного стекла с приклеенным к нему покровным стеклом, внутренняя поверхность которого была покрыта нитроцеллюлозой. В проточную камеру загружали 50 мкл сердечного миозина в высокоионном буфере АВ, содержащем 500 мМ KCl, на 2 мин, затем промывали последовательно высоко- и низкоионным буфером АВ и добавляли 50 мкл БСА в концентрации 0,5 мг/мл на 1 мин. Далее загружали 500 мкг/мл F-актина в буфере АВ с 2 мМ АТФ на 5 мин для блокировки неработающих миозиновых головок; после чего камеру трижды промывали буфером АВ. Далее добавляли 50 мкл раствора флуоресцентно меченых F-актина или тонких регулируемых филаментов в концентрации 10 нМ в буфере АВ, содержащем 100 нМ тропонин и 100 нМ тропомиозини, и инкубировали 10 мин. Затем промывали камеру буфером АВ с 0,5 мг/мл БСА, 3,5 мг/мл люкозы, 0,02 мг/мл каталазы, 0,15 мг/мл глюкозо-оксидазы, 20 мМ ДТТ, 2 мМ АТФ и 0,5 % метиллцеллюлозы. В случае экспериментов с регулируемым тонким филаментом раствор c АТФ содержал дополнительно 100 нМ тропонина и 100 нМ тропомиозина для предотвращения диссоциации регуляторных белков от актина. Необходимая концентрация свободного кальция в растворе достигалась добавлением Ca2+-ЭГТА. Все эксперименты были выполнены при температуре 28 ºС.

  1   2

Похожие:

Исследование функциональных характеристик изоформ сердечного миозина iconИсследование вклада сердечного миозин-связывающего белка с во взаимодействие сократительных белков миокарда
Работа выполнена в лаборатории биологической подвижности Учреждения Российской академии наук Института иммунологии и физиологии Уральского...
Исследование функциональных характеристик изоформ сердечного миозина iconИсследование космоса
Поиск и исследование внеземных форм жизни. Планетарный карантин, необходимый при этом
Исследование функциональных характеристик изоформ сердечного миозина iconВосстановление характеристик атмосферы по данным лидарного зондирования
Работа выполнена в гоувпо «Российский государственный гидрометеорологический университет»
Исследование функциональных характеристик изоформ сердечного миозина iconТема нир: Разработка технологий получения функциональных продуктов из фитомассы растений-интродуцентов и их рациональное использование
Вуз (организация), в котором проводится нир: Казанский государственный университет
Исследование функциональных характеристик изоформ сердечного миозина icon1 1 Разработка нового типа магистральных, самопромывных фильтров тонкой механической фильтрации на основе комплексных исследований гидродинамических характеристик фэ мембранного типа с заданной величиной поровых каналов
Разработка нового типа магистральных, самопромывных фильтров тонкой механической фильтрации на основе комплексных исследований гидродинамических...
Исследование функциональных характеристик изоформ сердечного миозина icon2. определение сферы исследования (сформулировать основные вопросы, ответы на которые мы хотели бы найти)
Исследовательская деятельность – творческая, и не существует общих универсальных правил и схем, по которым она развивается. Но все...
Исследование функциональных характеристик изоформ сердечного миозина iconОтчет по теме: «Исследование влияния «трансфер-фактора»
«Исследование влияния «трансфер-фактора» на процессы старения и репаративной регенерации в эксперименте и клинике»
Исследование функциональных характеристик изоформ сердечного миозина iconОсобенности взаимодействия сердечно-сосудистой и дыхательной систем настоящих тюленей в динамике функциональных состояний
...
Исследование функциональных характеристик изоформ сердечного миозина iconГубернская администрация и проблема кризиса власти в позднеимперской России на материалах Урала
Охватывает все этапы выстроенного со структурно-функциональных позиций комплексного исследования функционирования губернской администрации...
Исследование функциональных характеристик изоформ сердечного миозина iconСравнительный иммуно-флуоресцентный анализ рекомбинационных характеристик геномов млекопитающих Клеточная биология, цитология, гистология 03. 03. 04
Работа выполнена в лаборатории рекомбинационного и сегрегационного анализа Учреждения Российской академии наук Института цитологии...
Разместите кнопку на своём сайте:
поделись


База данных защищена авторским правом ©docs.podelise.ru 2012
обратиться к администрации
ЖивоДокументы
Главная страница